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產(chǎn)品詳情
一、標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系
10×擴(kuò)增緩沖液 10 ul
4種dNTP混合物 各200 umol/L
引物 各10～100 pmol
模板DNA 0.1～2 ug
Taq DNA聚合酶 2.5 u
Mg2+ 1.5 mmol/L
加雙或三蒸水至 100 ul
二、PCR引物設(shè)計(jì)
1.引物設(shè)計(jì)的基本原則
（1） 引物長度：15-30 bp，常用為20 bp左右。
（2） 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
（3） 引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。
（7） 引物的5 ′端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。
2.引物設(shè)計(jì)軟件
三、模板的制備
（1）PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。
（2）模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對(duì)象，可以是病原體標(biāo)本如病毒、細(xì)菌、真菌等。也可以是病理生理標(biāo)本如細(xì)胞、血液、羊水細(xì)胞等。法醫(yī)學(xué)標(biāo)本有血斑、精斑、毛發(fā)等。（3）標(biāo)本處理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標(biāo)本中的核酸。多數(shù)樣品需要經(jīng)過SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細(xì)菌，可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA，經(jīng)酚、氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應(yīng)模板。
四、PCR反應(yīng)條件的控制
1. PCR反應(yīng)的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 。
2. 鎂離子濃度總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5 mmol/L。
3. 底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制，20～200 umol/L。
4. TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul）。
5. 引物 濃度一般為0.1 ～0.5 umol/L。
6. 反應(yīng)溫度
（1）變性溫度和時(shí)間95℃，30 s。
（2）退火溫度和時(shí)間 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。
（3）延伸溫度和時(shí)間72℃，1 min/kb(10 kb內(nèi)）。
（4）Tm值=4(G+C) +2(A+T)
五、PCR的循環(huán)參數(shù)
模板DNA完全變性與PCR酶的完全激活對(duì)PCR能否成功至關(guān)重要，建議加熱時(shí)間參考試劑說明書，一般未修飾的Taq酶激活時(shí)間為兩分鐘。
2. 循環(huán)中的變性步驟
循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性，可能的情況下可 縮短該步驟時(shí)間，變性時(shí)間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴(kuò)增失敗。
3. 引物退火（Primer annealing）
退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴(kuò)增的長度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估。退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大影響。
4. 引物延伸
引物延伸一般在72℃進(jìn)行（Taq酶最適溫度）。但在擴(kuò)增長度較短且退火溫度較高時(shí)，本步驟可省略
延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長短而定，一般推薦在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1 min/kbp
5. 循環(huán)數(shù)
大多數(shù)PCR含25-40循環(huán)，過多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。
6. 最后延伸
在最后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在72℃維持5-15分鐘．使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。
六、PCR步驟
1. DNA變性
（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下， 氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。
2. 退火
（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。
3. 延伸
（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。
七、PCR檢測(cè)
PCR反應(yīng)擴(kuò)增出了高的拷貝數(shù)，下一步檢測(cè)就成了關(guān)鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是最常用的檢測(cè)手段。電泳法檢測(cè)特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因?yàn)槠浜喗菀仔校蔀榱酥髁鳈z測(cè)方法。近年來以熒光探針為代表的檢測(cè)方法，有逐漸取代電泳法的趨勢(shì)。
